實體瘤CAR-T細胞治療分析
背景介紹：
細胞治療是近幾年興起的治療新技術，是指利用某些特定功能的細胞的特性，采用生物工程方法獲取或通過體外擴增、特殊培養等處理后，產生的特異性功能強大的細胞，回輸體內后，從而達到治療疾病的目的。
過繼性細胞治療已經研究經過十多年了，并且一直是研究的熱點。其中包括LAK，DC，CIK，DC-CIK，CAR-T，TCR-T，NK，CAR-NK，腫瘤浸潤性淋巴細胞（TILs）等等。但是大浪淘沙，隨著研究的開展，能成功的治療方式并不多。其中CAR-T和TCR-T在研究中展現出出色的療效。而LAK，DC，CIK，DC-CIK基本被證明是無效的，或基本無效，雖然仍然有一些學者在艱苦研究DC相關的治療策略，但是目前未看到良好的成果。而NK/CAR-NK和Treg/CAR-Treg還處于早期研究，前路未明。
CAR-T技術原理
CAR-T技術（ChimericAntigen Receptor T-Cell，即T細胞嵌合抗原受體）通過基因工程手段修飾人的T細胞，使其表達嵌合抗原受體(chimeric antigen recetor, CAR)，即將識別腫瘤細胞表面抗原的抗體與激活T細胞所需的信號分子連接，以此增強T細胞對腫瘤的特異性殺傷。
TCR-T細胞、CAR-T細胞與體內正常T細胞一樣都是通過T細胞對特異性癌癥細胞抗原的識別能力和進攻能力。TCR-T與CAR-T通過基因改造的手段提高T細胞受體對特異性癌癥細胞抗原的識別。因此也都統稱為“T細胞受體重新定向”技術（T cell receptor redirection）。但是CAR-T與TCR-T的抗原識別機制是完全不同的。TCR-T細胞與體內的正常T細胞識別的抗原是需要通過MHC分子呈遞。而CART則利用能夠與特定抗原結合的抗體片段來識別腫瘤細胞表面的抗原。識別方式上的差異導致TCR-T和CAR-T在應用領域有著相應不同的優勢和劣勢。
政策
至2016年以來，CAR-T行業的監管政策層出不窮。政策主要是來自國家藥監局和衛健委兩個層面的。
2019年3月的《體細胞治療臨床研究和轉化應用管理辦法》核心內容是明確了醫療機構作為責任主體，進行體細胞治療等新技術的臨床研究，獲得安全有效性數據后，可以申請臨床應用并收費。但是個人覺得不必擔心行業再進入出現“魏則西“事件的那個年代。中國醫療行業經歷了這么多年的發展，監管部門也已經意識到了監管的重要性。細胞質量產品的開發是一個復雜的過程，需要建立一整套體系才能達到穩定的質量控制，醫院是否能投入這一體系建設還要面臨很多現實的考慮。
小結：
FDA的監管宗旨是以風險為導向的監管體系，現在已經明確以藥物監管的方式來監管CAR-T，中國實行雙軌制也是為了“提速”臨床，但根據美國發展來看未來依然是以藥物監管為主導。
CAR-T的發展現狀
1.國際進展：
2017年，美國批準了兩款自體CAR-T產品，針對血液瘤，療效顯著，但復發率高，價格昂貴，當前滲透率還較低。全球在研依然火熱，國內臨床在研數量和美國持平。
2.國內進展：
國內無產品上市，大概20幾家企業申報臨床，約30個產品，其中11個產品獲批臨床，國內CAR-T研發特點：
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競爭激烈，同質化嚴重；
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創新少，基本是模仿國外產品，缺少獨立IP；
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國內企業在后期的生產工藝上較國外還是有差距，很多企業在正規的生產環節會遇到瓶頸。
3.CAR-T行業痛點：
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自體治療，費用高，市場受限；
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血液瘤，市場天花板低，實體瘤問題沒解決；
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安全性問題大，復發率高。
4.未來發展趨勢：
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降低制備成本，比如從自體走向通用型；
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實體瘤攻克；
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提高安全性，降低復發率。
表1 CAR-T各個靶點國內競爭情況
CAR-T的局限：從血液瘤到實體瘤
CAR-T在血液瘤上的成效是有目共睹的，在全球性ELIANA試驗中，Kymriah治療后3個月的完全緩解率為83%，6個月的生存率為89%。ZUMA-1試驗的初步分析顯示，惡性淋巴瘤患者接受YESCARTA單次輸注治療后，總緩解率為82%，完全緩解率為54%。中位隨訪8.7個月，44%的患者仍保持緩解，6個月的完全緩解率為47%。雖然CAR-T在血液瘤上大放異彩，但是在實體瘤的應用上頻頻受限。對比血液瘤，在實體瘤上CAR-T應用有如下難點。
1、實體瘤靶點選擇問題
第一，實體瘤靶點選擇問題。血液瘤靶點CD19會在所有的B細胞上表達卻不在其他組織和血液細胞中表達，血液中也未曾檢測到CD19可溶性蛋白的存在，CD19是B淋巴細胞白血病的一個非常理想的靶點。但是實體瘤的異質性是實體腫瘤更為突出的特點之一，這也意味著即使是同一位患者一個部位的腫瘤也并非均表達相同的腫瘤相關性抗原。即使在一個腫瘤病灶上，無一種靶抗原可以覆蓋全部的腫瘤細胞。
2、實體瘤浸潤問題
第二，CAR-T對于實體瘤的浸潤問題。血液環境是一種勻質的環境，不存在CAR-T的浸潤問題。而實體瘤則具有纖維組織的腫瘤屏障，且屏障內部腫瘤微環境是一種低PH、低氧、低營養、高滲透壓的環境，不利于CAR-T細胞的浸潤激活增殖。
另外腫瘤高內皮小靜脈（HEV），人體正常T細胞浸潤發炎或者病變組織的方式是通過扁平的毛細血管進行HEV變化。T細胞通過HEV的表皮細胞定位并浸潤組織。在腫瘤晚期，腫瘤細胞釋放多種細胞因子損害HEV表皮細胞，因此腫瘤組織的形成的血管缺少表皮細胞，無法成為成熟的HEV血管。不成熟的HEV血管導致了T細胞的浸潤能力下降。
3、腫瘤微環境
第三，免疫抑制的腫瘤微環境。實體瘤微環境中，不僅有TGF-β等免疫抑制因子，腫瘤細胞表面也會表達多種免疫抑制信號。另外，腫瘤微環境中還有Treg等免疫抑制調控細胞，CAR-T在進入腫瘤微環境之后，收到多種免疫抑制信號的調控，抑制其活性。
實體瘤CAR-T進展
1、靶點選擇
不像血液瘤中CD19表達于所有B細胞表面，實體瘤的抗體選擇更為復雜。常見的實體瘤靶點有HER2，CEA，EGFR，GD2，PSMA，Mesothelin,MUC1等都是腫瘤相關性靶點，在腫瘤中高表達，在正常組織中也有少量的表達。比如HER2靶點廣泛出現在乳腺癌中，但是在正常的心肺組織中，也有少量表達。曾有有患者接受了靶向HER2的CAR-T治療，在5天之后，因為CAR-T誘導的心肺功能衰竭而死亡。實體瘤靶點有EGFR/EGFRvIII，HER2，CEA，MSLN，FAP，cMet，GPC3，GD2，MUC1，L1-CAM等。
表2 CAR-T實體瘤靶點
資料來源：Nature,公開資料
表3 各個實體瘤靶點在腫瘤組織和正常組織中的表達情況
小結：
從上表來看，除了GPC3之外，其他蛋白抗原都存在與人體正常組織中，因此控制CAR-T的on-target毒性成為非常關鍵的因素。根據臨床推進來看，可以關注MSLN，GPC3以及新型腫瘤特異性靶點在臨床上的進展。
2、CAR-T的浸潤及微環境克服策略：
在找到靶點后，CAR-T如何找到實體瘤并且浸潤發揮作用又是另一難題。一是腫瘤血管不成熟，扭曲導致在實體瘤內部幾乎沒有T細胞被發現。因此一些血管形成的靶點如VEGF聯合CAR-T的治療會幫助CAR-T的浸潤。
另外，CAR-T的定位需要一些炎癥因子如CCL2，而腫瘤細胞很少釋放這類因子，曾有臨床前試驗在動物模型中用攜帶CCL2基因的牛痘病毒去感染腫瘤細胞，在感染后腫瘤周圍發現了許多CAR-T細胞被招募。
最后腫瘤表面有一層纖維組織，這層組織成為了腫瘤的物理屏障。有一個方法是使CAR-T細胞同時表達乙酰肝素酶，通過乙酰肝素酶降解腫瘤的纖維化細胞外基質，克服物理屏障。
實體瘤內部會產生多種免疫抑制的信號，如PD-L1高表達，TGF-β等免疫抑制因子，這些免疫抑制環境會抑制Car-T發揮其效用。在技術發展過程中，攜帶炎癥因子或者PD-1敲減的CAR-T產品逐漸出現。在2018年，上海普珩生物技術有限公司宣布，用于治療轉移性腎細胞癌的兩個新型腫瘤酸性微環境激活CAR-T產品臨床試驗信息正式公布在clinicaltrials.gov上。這款CAR-T利用腫瘤內部原本具有抑制作用的酸性環境激活，既解決了腫瘤內部的酸性環境抑制，又解決了CAR-T的脫靶毒性問題。
但是這些方法在臨床上的驗證相對較少，臨床階段處于早期而且樣本量較小。另外并沒有某種方式呈現出巨大的療效，實體瘤CAR-T的發展還有很長一段路要走。
表4 采用不同策略下的實體瘤CAR-T臨床試驗
行業地圖
目前，幾家大型的CAR-T療法公司對實體瘤的布局有限，諾華和Bluebird的CAR-T細胞治療產品在實體瘤也只有較少布局，吉利德科學雖然也沒有，但有一個探索性的TCR研究，國外多以研究所機構布局為主。
表5 國際上獲得實體瘤CAR-T臨床批件的機構
表6 國內獲得實體瘤CAR-T臨床批件的企業
小結：
可以看到實體瘤CAR-T的進展還處于比較早期階段，絕大多數臨床還處于早期的臨床階段，樣本量較少。通過基因編輯“武裝”CAR-T和條件激活CAR-T成為主流嘗試方向。從上述臨床數據來看，Atara針對MSLN靶點治療多線耐藥后的乳腺癌，入組27人緩解率達到50%以上，治療效果和樣本量都不錯。
國外可以關注諾華，Juno等大藥企的動向，國內可以關注科濟生物的進展。科濟生物是國內CAR-T實體瘤治療的領軍企業，其創新靶點CLDN18.2治療胃癌也達到了33.3%的ORR，值得關注。
CAR-T產業化難點：從自體CAR-T到異體CAR-T（UCAR-T）
CAR-T的產業化存在兩個關鍵性的環節，一是用于制備CAR-T的CAR的慢病毒載體；二是CAR-T產品的制備，儲存，質量控制工藝。Kite花了將近1年的時間將CAR-T產品的制備出廠時間從10-12天降低為6-9天。由此可見CAR-T的制備工藝具有較高的壁壘。目前自體回輸型CAR-T的GMP工藝流程如圖四所示。可以看到CAR-T的制備工藝階段繁多，并且由于細胞產品極易被污染，環節與環節之間的過渡需要在封閉的環境下進行。諾華采用的措施是通過自動化或者半自動化的系統減少污染的幾率。
自體回輸的CAR-T制備工藝經過：T細胞采集及儲存-T細胞的富集-T細胞激活-T細胞轉導修飾-T細胞擴增-成品CAR-T儲存等。質量控制和檢測環節貫穿整條工藝線。在整個工藝流程中，有幾個關鍵環節和關鍵指標需要注意。以下分析的基礎為已上市的兩款CAR-T產品和中國食品藥品檢定研究院發布的CAR-T的生產考慮要點。
圖7 CAR-T的GMP工藝流程
T細胞采集純化：
也即 T 細胞的獲取 一般為從血液中分離純化 而純化的方法也可以分成培養過程中調整培養基進行選擇和直接磁珠法分選等手段與企業整個 T 細胞 處理的思路有關 需要全面考察其 技術路線和分離的純度、收獲率、活細胞率等。
轉染 ：
轉染環節 最直觀的指標為轉染效率 （陽性率諾華為 50%，國內企業從 20%-80%不等，但過高可能意味著 CAR 基因啟動子強度過高或者病毒使用過多，存在致癌風險，因此追高無意義，只要滿足使用所需的細胞絕對量即可。
T細胞擴增：
細胞培養是比較成熟的環節，但也是比較考驗企業工藝的環節，培養基、生長因子、細胞因子等的選擇和操作規程都比較重要。細胞因子等的選擇和操作規程都比較重要。此環節主要指標為擴增時間和倍數指標為擴增時間和倍數，國內和國外都將擴增時間控制在1-2周，擴增倍數在100倍左右。
回輸：
血液瘤CAR-T 一般按每公斤體重約106的細胞量進行回輸 但也要參考患者的具體情況 。對實體瘤而言 直接在腫瘤部位給藥并不能提高治療效果，但有報道稱在腫瘤部位植入含 CAR-T 細胞的微型裝置并緩釋細胞因子進行持續刺激可以提高對實體瘤的效果，需要驗證。
總結來看，目前CAR-T工業化存在的難點有如下幾點：
1、自體回輸型CAR-T需要根據個體差異提取細胞，提取的原材料的細胞數量，活性，細胞亞群比例均不同，需要標準化的通用型CAR-T細胞產品，但是現在UCAR-T的安全性依然存疑。
2、傳統CAR-T生產需要病毒載體，病毒載體的質量將直接影響后續CAR-T生產中的轉染效率和安全性問題。其他轉染方式制備CAR-T的技術還不成熟。
3、CAR-T的制備工藝步驟繁多，質量控制耗費巨大。整條產線各個環節要求盡量減少在外界的暴露，國外CAR-T的產線構建是以半自動化或全自動化為標準，目前國內已有的CAR-T產線還未達到半自動化標準。
4、CAR-T的產業標準還不成熟。
投資邏輯：小結
實體瘤CAR-T企業投資邏輯除了關注產業化制備工藝，成本問題，產品安全性，研發進度及團隊之外，更要關注如何解決實體瘤CAR-T的三大難點，并且要關注臨床前和臨床試驗數據的支持。
1、產品靶點選擇
2、腫瘤微環境的克服
3、浸潤問題，并且關注相關臨床前和臨床試驗數據支持。
目前已有的策略：
一是讓CAR-T攜帶并表達各種各樣的免疫因子，分泌PD-1抗體或者是PD-1敲除的CAR-T等。
二是使CAR-T進行條件激活，在TME環境下特異性激活CAR-T。
三是多方案聯合治療。
CAR-T實體瘤上的進展還相對處于早期，這些想法還沒有在臨床上得到大數據樣本的驗證。
